# 细菌的免疫档案：CRISPR 原本靠什么保命，今天的工具又把哪一步省掉了

获取、表达、干扰三步里，实验室只留下了最后一步——以及为什么 PAM 是这套系统不砸自己档案柜的开关

> 基因编辑历史背景 · PAM 识别机制 · gRNA 设计原理 · 约 6 分钟 · 10 月 23 日

## 本篇要点

1. 细菌的 CRISPR 系统是一套可遗传的适应性免疫，分获取、表达、干扰三步。
2. 获取阶段由 Cas1–Cas2 把入侵 DNA 的一段剪成固定长度，插进阵列靠近 leader 的一端成为 spacer，两侧由 repeat 夹住；PAM 在这一步就影响选哪段。
3. 表达阶段整条阵列转录成长前体，再切成一条条 crRNA；II 型系统还需要与 repeat 互补的 tracrRNA 配对，才凑成完整的导航装置。
4. 干扰阶段 Cas9 先扫 PAM，再解开双链让 crRNA 做碱基互补配对，配对成功后 HNH 与 RuvC 分别切两条链。
5. PAM 的天然作用是自我/非我判定：阵列里的 spacer 两侧是 repeat、没有 PAM，所以 Cas9 不切自己的档案。
6. 实验室版本丢掉了获取（不需要 Cas1、Cas2，靶点由人挑）和加工（crRNA 与 tracrRNA 缝成 sgRNA），只保留干扰这一环的执行机构。
7. 代价是同一套逻辑换了环境：PAM 从防自伤的保护，变成人类基因组编辑中脱靶风险的来源，也变成有些位点改不到的门槛。

---

今天我们手里的编辑工具，零件少得有点不真实：一个 Cas9 蛋白，一条向导 RNA，外加一条“靶点旁边必须有 PAM”的规矩。可在细菌体内，同一个系统的零件要多得多——它还得会采集样本，还得会整理档案。而我们做实验时，这些活全都不干。

那就要问：为什么能砍掉这么多？砍掉的是哪些？留下的那部分，为什么非留不可？

把细菌里这套系统完整走一遍，这几个问题都有答案，还会顺带解释一件原本很难想通的事：为什么必须有一小段看起来跟靶点无关的 PAM。

## 先看细菌怎么对付病毒

细菌天天被噬菌体（专门感染细菌的病毒）攻击，而它们没有抗体、没有免疫细胞。办法很朴素：**出事之后留证据**。

噬菌体把 DNA 打进细菌体内，细菌如果活下来了，会从入侵者的 DNA 上剪下一小段，存进自己基因组里一个专门的区域。下次同一个噬菌体再来，细菌就照着这段存档发一张“照片”出去，让保安按照片认人，认出来就当场剪断入侵的 DNA。

存档的地方就是 CRISPR。那些各不相同的存档片段叫**间隔序列**（spacer），每段之间夹着几乎相同的**重复序列**（repeat），排成一长串：

```
repeat — spacer₁ — repeat — spacer₂ — repeat — spacer₃ — repeat …
```

每个 spacer 对应一次曾经的入侵。这段档案会随细菌分裂传给子代，所以它不只是免疫，还是可以遗传的免疫记忆。

![CRISPR-Cas 的三个阶段：新间隔序列被整合进 CRISPR 阵列，阵列转录并加工成 crRNA，crRNA 引导 Cas 蛋白识别并切割入侵 DNA](https://cdn.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/blobs/7583/4417044/be7c416dcf6d/nihms-663384-f0001.jpg)

整套天然免疫分三步。

## 第一步：把入侵者的片段剪进档案

这一步叫**获取**。主力是两个蛋白，Cas1 和 Cas2：在大肠杆菌里只把这两个蛋白过表达，就足以让细菌往阵列里塞新片段，说明获取只需要它们俩[2]。它们卡住一段双链 DNA，把它切成固定长度，插进阵列开头（靠近 leader 的一端），再复制一份 repeat 把新片段夹住。

这段从入侵者身上剪下来的序列有个专门名字：**前间隔序列**（protospacer）。它进了阵列之后才叫 spacer。

要紧的是，**剪哪一段不是随便剪的**：获取机器偏好入侵 DNA 上紧挨着某个特定短序列（也就是 PAM）的那些片段。也就是说，PAM 在“采集样本”这一步就已经被看上了，不是等到最后切割才出场[3]。

## 第二步：把档案复印成照片

有了档案还得能调出来用。整条阵列先被转录成一条很长的 RNA 前体，再被切成一节一节，每一节是一个 spacer 加两侧 repeat 的残余。切出来的小 RNA 叫 **crRNA**，它就是发出去认人的那张照片[2]。

只有照片还不够。2011 年 Charpentier 组发现，这套系统还需要第二个小 RNA：它的序列和 repeat 互补，所以能和 crRNA 配成一对，两个抱在一起才算完整的导航装置，它叫 **tracrRNA**[6]。分工是：crRNA 拿照片，tracrRNA 负责把照片和保安拴在一起。

## 第三步：认出、解开、切掉

保安 Cas9 带着这一对 RNA 在细胞里巡逻，遇到 DNA 做两件事，顺序固定。

**先找 PAM。** Cas9 不会一上来就把 DNA 整条解开看序列，太慢也太贵；它先扫过 DNA 表面，只认那几个碱基的 PAM，没有 PAM 的地方连配对都不试[4]。

**找到了才配对。** 它把双链局部解开，让 crRNA 去和其中一条链做碱基互补配对。配上了，就是照片上那个人：Cas9 的两个切割结构域同时动手，HNH 切与 crRNA 互补的那条链，RuvC 切另一条，在 PAM 上游几个碱基处留下一处双链断裂[1][6]。

入侵者的 DNA 被切断，对细菌来说感染基本就结束了。

## 档案馆为什么不会被自己砸掉

到这里有个别扭的地方：crRNA 的序列，和细菌自己基因组里的 spacer 一模一样。保安照照片认人，凭什么不砸自己的档案柜？

答案是 PAM。阵列里的 spacer 两侧是 repeat，**没有 PAM**。Cas9 巡逻到自己这段时，第一步就过不去，配对根本不启动。自我与非我的判定，就落在这几个碱基上[4]。

这个设计有多要命，反面也能看出来：逃出免疫的噬菌体，往往是 PAM 那个位置被突变了[2]。这套免疫的强度，整个押在一个短序列上。

![Cas9 的两道检查：先探 PAM 再比序列；基因组里的 spacer 因为两侧没有 PAM 而逃过自我切割；实验室用的 sgRNA 是把天然的 crRNA 与 tracrRNA 缝成一条](https://media.springernature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1038%2Fs41467-020-20633-y/MediaObjects/41467_2020_20633_Fig1_HTML.png)

## 到实验室：三步只剩一步半

有了这条线，今天手里的工具就很好拆了。

**获取整段扔掉。** Cas1、Cas2 从没出现在编辑工具里。为什么能扔？细菌需要“获取”，是为了应付它没见过的病毒，得自己决定存哪一段；而我们要改的位点是自己挑的，向导也是自己写的，不需要细胞去学。

**加工也被扔掉，只留成品。** 整个阵列、RNA 前体、剪切酶都不需要。2012 年，Charpentier 和 Doudna 把 crRNA 和 tracrRNA 用一段连接序列缝成一条 RNA，也就是 **sgRNA**（单链向导 RNA）。理由很实际：两个 RNA 要各自合成、各自配对太麻烦，连成一条只要合成一条[1]。所以今天设计 gRNA 时，前面那 20 个碱基是你挑的靶序列，后面那段固定骨架，来源就是 tracrRNA。

**干扰基本原封不动。** Cas9 蛋白、PAM 扫描、碱基互补配对、双链切割，一件没少。前面拆过的机制——[PAM 提供锚点，gRNA 靠互补定位，两个结构域分别切两条链](https://pangzhengboyin.com/articles/how-crispr-cas9-works-guide-rna-72fa16c3)——说的全是这一步。

所以今天的工具不是“缩小版的细菌免疫系统”，而是只保留了最后一环的执行部分：一个会自己学习、自己存档的系统，被改成了只会执行命令的机器。命令从人来。

## 同一处保护，换了环境就变味

最后一点后果值得说清。

在细菌里，PAM 是保护自己不被误伤的机制。到了人类基因组，这层保护的含义变了：我们的基因组里没有“档案区”，每个和靶序列相似的位点，都可能长成被认出来的样子。同一套逻辑，原本防自伤，现在成了**脱靶**的来源。

同一个 PAM 还制造另一种麻烦：它是一道门槛。有些位点序列再合适，旁边没有合适的 PAM，Cas9 就是不去，这个位点也就改不了[4]。所以大量研究在做放宽 PAM 要求的新酶——不是为了锦上添花，而是为了能不能改到。

细菌的 CRISPR 是三步：把入侵者的片段存进阵列（Cas1、Cas2 干活），把阵列切成一条条 crRNA 并配上 tracrRNA，再由 Cas9 按 PAM 找位置、按序列确认、切断双链；PAM 则保证这套系统不砸自己的档案柜。实验室版本砍掉了前两步，只留下第三步的执行机构，代价是自然界用来防自伤的短序列，在人类基因组里同时成了风险的来源和改不到某些位点的门槛。

## 术语表

- 间隔序列与重复序列（spacer / repeat）：CRISPR 阵列的两种组成，repeat 彼此几乎相同、把一段段各不相同的 spacer 隔开，每个 spacer 对应一次曾经的入侵。
- 前间隔序列（protospacer）：入侵 DNA 上被剪下来、准备存进阵列的那一段；存进去之后才叫 spacer。
- 获取阶段：天然免疫的第一步，Cas1–Cas2 把入侵片段切成固定长度并插进阵列开头，PAM 在这一步就影响选哪段。
- crRNA：从阵列转录、加工出来的小 RNA，携带一段 spacer 序列，相当于发出去认人的“照片”。
- tracrRNA：与 repeat 互补的小 RNA，和 crRNA 配成一对，把照片和 Cas9 拴在一起；实验室用的 sgRNA 就是把它和 crRNA 缝成一条。
- 干扰阶段：Cas9 按 PAM 找位置、按碱基互补确认目标并切断双链，是天然免疫的最后一步，也是编辑工具唯一全盘保留的部分。

## 来源

1. [Jinek et al., A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity (Science, 2012) — crRNA 与 tracrRNA 双 RNA 引导 Cas9 切割，以及缝成单条 sgRNA 的原始论文](https://www.science.org/doi/10.1126/science.1225829)
2. [The Structural Biology of CRISPR-Cas Systems — 适应、表达、干扰三阶段综述，含阵列结构、PAM 缺失避免自切割、噬菌体突变 PAM 逃逸](https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4417044/)
3. [Structural and Mechanistic Basis of PAM-Dependent Spacer Acquisition in CRISPR-Cas Systems (Cell, 2015) — 获取阶段如何识别 PAM 并决定 spacer 长度](https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(15)01321-5)
4. [CRISPR technologies and the search for the PAM-free nuclease (Nature Communications, 2021) — PAM 的自我/非我识别作用及其对可编辑位点的限制](https://www.nature.com/articles/s41467-020-20633-y)
5. [Cas1–Cas2 complex formation mediates spacer acquisition during CRISPR–Cas adaptive immunity — 获取阶段只需 Cas1 与 Cas2 的证据](https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4075942/)
6. [Broad Institute: CRISPR Timeline — 2007 年酸奶菌实验、2011 年 tracrRNA 发现、2012 年体外重构的年表](https://www.broadinstitute.org/what-broad/areas-focus/project-spotlight/crispr-timeline)

---

原文：https://pangzhengboyin.com/articles/crispr-natural-immunity-three-stages-9ebd603c

> **庞征博引** · 想学的，慢慢都会
>
> 庞征博引是把想学的东西写成连载的 AI 学习工具。说出想学什么，它会先了解你的基础，再把主题写成一篇篇 5–10 分钟能读完的文章；边读边问，接下来学什么跟着你走。这篇就是这样写出来的。
>
> 开始你自己的连载 → https://pangzhengboyin.com